ساب کلونینگ و مقایسه ی فعالیت نوع طبیعی آنزیم تیروزیناز انسانی با انواع جهش یافته ی آن (m374t و m374d) در رده ی سلولی hek-293

thesis
abstract

آنزیم تک زنجیره ای حاوی مس تیروزیناز، یک گلیکوپروتئین غشایی نوع i است که به گروه پروتئین های وابسته به مس نوع 3 تعلق دارد. این آنزیم در جایگاه فعال خود دارای دو اتم مس است که هریک توسط سه ریشه ی بسیار حفظ شده ی هیستیدین در موقعیت مناسب برای واکنش قرار می گیرند. تیروزیناز انسانی از اکسیژن ملکولی برای انجام دو مرحله ی اول مسیر سنتز ملانین یعنی ارتو-هیدروکسیلاسیون l-تیروزین به l-دوپا (فعالیت تیروزین هیدروکسیلازی) و اکسیداسیون متعاقب آن ها به دوپاکینون (فعالیت دوپا اکسیدازی) استفاده می کنند. در پژوهش قبلی این آنزیم برای به دست آوردن نوع جهش یافته ی دارای فعالیت دوپا اکسیدازی بیشتر مورد مهندسی پروتئین قرار گرفت. m374 یک ریشه ی بسیار حفظ شده در خانواده ی پروتئین های مس نوع 3 است که در جایگاه فعال تیروزیناز انسانی قرار گرفته است. این اسید آمینه در پژوهش قبلی با چهار اسید آمینه ی ترئونین (m374t)، آسپارتیک اسید (m374d)، لیزین (m374k) و آرژینین (m374r) تعویض شد و فعالیت اختصاصی آنزیم نوترکیب و این چهار جهش یافته در سویه ی e.coli bl21 مورد بررسی قرار گرفت. مشخص شد که دوجهش یافته ی اول فعالیت دوپا اکسیدازی بالاتری نسبت به نوع نوترکیب آنزیم دارند. در پژوهش کنونی، آنزیم نوترکیب به همراه دو جهش یافته ی اول به عنوان مدلی برای بررسی فعالیت دوپا اکسیدازی تیروزیناز انسانی در رده ی سلولی hek-293 بیان شدند. توالی های رمز کننده ی تیروزیناز پیشتر در حامل pet-28a(+) کلون شده بودند. قدم اول سابکلون قطعات رمز کننده ی تیروزیناز طبیعی و انواع جهش یافته m374d و m374t در pcdna3.1/his/lacz بود. برای معادل سازی تولید پروتئینی با شرایط تاخوردگی مشابه در تروزیناز های یوکاریوتی، توالی رمز کننده ی lacz به طور کامل خارج شده و توالی های رمز کننده تیروزیناز بدون حضور سیگنال نشانه به جای آن کلون شدند. برای تهیه میزان کافی از واریانت های آنزیمی مورد نظر برای اندازه گیری های بیوشیمیایی، نزدیک به 9 میلیون سلول hek293 با هر واریانت ترانسفکت شد. پس از گذشت نزدیک به 30 ساعت از زمان ترانسفکشن، هرنمونه با استفاده از بافر لیز-اتصال، لیز شد و محتویات آن با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی خالص سازی شدند. فعالیت آنزیمی هیچ یک از نمونه ها قابل تشخیص نبود. برای کمک به تاخوردگی بهتر انواع آنزیمی، مراحل ترانسفکشن، لیز و خالص سازی همانند آنچه شرح داده شد، مجدداً انجام گشت. تنها تفاوت افزوده شدن l-dopa استریل با غلظت نهایی 1 mm به سلول ها بود. این بار نیز فعالیت آنزیمی قابل تشخیصی مشاهده نشد. تمام مراحل فوق بار دیگر تکرار شد و l-dopa با cuso4 با غلظت نهایی ?m 100 جایگزین شد. از آنجایی که فعالیت آنزیمی مشاهده نشد، حضور احتمالی یک مهار کننده در مراحل مختلف بررسی شد. مشخص شد که nacl مهار کننده تیروزیناز بوده و قادر به مهار کامل فعالیت تیروزیناز در غلظت ?m 800 می باشد. به همین منظور به جای خالص سازی نمونه های آنزیمی، فعالیت نسبی نمونه-های مختلف بررسی گشت. کلیه مراحل لیز سلول های ترانسفکت شده در داخل بافر pbs محتوی تریتون x-100 و مهار کننده ی پروتئاز انجام شد. پس از بررسی نمونه ها، جذب در محدوده ی 03/0-02/0 برای تمامی نمونه ها مشاهده شد که به دلیل پایین بودن مقادیر مشاهده شده نمی توان با اطمینان کامل آن را مرتبط به فعالیت دوپا اکسیدازی دانست. برای اطمینان از بیان مناسب سازه ها rt-pcr نیمه کمی در سطح rna و آنالیز وسترن بلات در سطح پروتئین انجام شد که نشان دهنده ی تولید شدن تمامی نمونه های آنزیمی در هر دو سطح بود. آنالیز وسترن بلات غلظت بسیار پایینی از تمامی نمونه ها نشان دارد. به همین دلیل اندازه گیری فعالیت آنزیمی نیازمند تهیه رده های سلولی که دائماً واریانت های مختلف آنزیم را تولید کنند است و کشت این رده های سلولی در حجم های بیشتر باید انجام گیرد که شامل حداقل 20 میلیون سلول در حال کشت برای هر نمونه می شود.

similar resources

Survey of the nutritional status and relationship between physical activity and nutritional attitude with index of BMI-for-age in Semnan girl secondary school, winter and spring, 2004

دیکچ ه باس فده و هق : ب یناوجون نارود رد هیذغت تیعضو یسررب ه زا ،نارود نیا رد یراتفر و یکیزیف تارییغت تعسو لیلد ب تیمها ه تسا رادروخرب ییازس . یذغتءوس نزو هفاضا ،یرغلا ،یقاچ زا معا ه هیذغت یدق هاتوک و یناوـجون نارود رد یا صخاش نییعت رد ب نارود رد یرامیب عون و ریم و گرم یاه م یلاسگرز ؤ تـسا رث . لماوـع تاـعلاطم زا یرایسـب لـثم ی هتسناد طبترم هیذغت عضو اب بسانم ییاذغ تاداع داجیا و یتفایرد یفاضا...

full text

مقایسه تأثیر وضعیت طاق باز و دمر بر وضعیت تنفسی نوزادان نارس مبتلا به سندرم دیسترس تنفسی حاد تحت درمان با پروتکل Insure

کچ ی هد پ ی ش مز ی هن ه و فد : ساسا د مردنس رد نامرد ي سفنت سرتس ي ظنت نادازون داح ي سکا لدابت م ي و نژ د ي سکا ي د هدوب نبرک تسا طسوت هک کبس اـه ي ناـمرد ي فلتخم ي هلمجزا لکتورپ INSURE ماجنا م ي دوش ا اذل . ي هعلاطم ن فدهاب اقم ي هس عضو ي ت اه ي ندب ي عضو رب رمد و زاب قاط ي سفنت ت ي هـب لاتـبم سراـن نادازون ردنس د م ي سفنت سرتس ي لکتورپ اب نامرد تحت داح INSURE ماجنا درگ ...

full text

ساب کلونینگ ژن آنزیم گلوکوسربروزیداز موش سوری در وکتور لنتی ویرال و انتقال آن به رده سلولی HEK

سابقه و هدف: ژن‌درمانی یکی از مهم­ترین شیوه‌های تحقیقات بالینی است که ارایه‌دهنده­ی روش‌های جدیدی برای درمان نقص‌های ژنتیکی می‌باشد. نقص ژنتیکی آنزیم گلوکوسربروزیداز ( Gba ) عامل بیماری گوشه بیش از بقیه‌ی بیماری‌ها در ژن‌درمانی مورد توجه قرار گرفته است. هدف از انجام این پروژه کلونینگ و انتقال ژن آنزیم گلوکوسربروزیداز توسط لنتی ویرال وکتور ارتقایافته به رده‌ی سلول‌های HEK می‌باشد. مواد و روش‌ها:...

full text

Survey of cancer incidence during a 5-year (1998-2002) period in Semnan province

هدیکچ هقباس و فده : ناطرس زا بسانم تاعلاطا اب یم صاخ یئایفارغج هیحان رد فلتخم یاه همانرب ناوت ار یبط یاه یارب لابرغ و نامرد یرگ ) Screening ( هورگ دومن صخشم رطخرپ یاه . نآ زا هک اج گرم نازیم نانمس ناتسا تشادهب زکرم لااب ریم و ی زکرم رد یناقوف شراوگ هاگتسد ناطرس رثا رب ار ی ا هدرک شرازگ ناریا تس . یماـمت تـبث و یـسررب یارـب تفریذپ ماجنا یعماج قیقحت نانمس ناتسا یموب تیعمج نیب رد ناطرس دراوم ...

full text

Larp _icee 2009_

کچ ی هد هکبش هکبش رگسح یاه رگسح زا یا هنیزه مک و دودمح یژرنا اب ،کچوک یاه دنتسه یا یم شخپ رظن دروم هقطنم رد هک هداد ات دنوش عجم طیمح زا ار ییاه شزادرپ یارب و هدونم یروآ یزکرم هرگ هب ١ دننک لاسرا . م نینچهم ی هب و هداد صیخشت طیمح رد ار یدادخر عوقو دنناوت دنناسرب یزکرم هرگ علاطا . هکبش هنوگنیا ریخا یالهاس رد هنیمز رد اه یاهدربراک فلتمخ یاه هدرک ادیپ یدایز دنا . زا دنترابع اهدربراک نیا هلجم زا...

full text

The Effect of Astrocytic S100B Protein on Memory Conolidation Rats

همدقم : نیئتورپ S100B ورون طابترا لرتنک رد و دوش یم دازآ اه تیسورتسآ زا هک تسا ینیئتورپ ، لگ ی یلا دراد شـقن یسپانیس يریذپ لکش و هظفاح رد لاامتحا و . هـعلاطم ادروخرب یصاخ تیمها زا نورون و تیسورتسآ لولس ود يدرکلمع طابترا تسا ر . ياـه شوـم رد يریگداـی يور رـب پـماکوپیه نورد هـب نیئتورـپ نیا قیرزت رثا رضاح هعلاطم رد تفرگ رارق یسررب دروم ییارحص . شور اه : زا قیقحت نیا رد 40 دش هدافتسا رن ییا...

full text

My Resources

Save resource for easier access later

Save to my library Already added to my library

{@ msg_add @}


document type: thesis

وزارت علوم، تحقیقات و فناوری - دانشگاه تربیت مدرس - دانشکده علوم زیستی

Hosted on Doprax cloud platform doprax.com

copyright © 2015-2023